液相色谱仪验证方案（精选4篇）
目 录1.设备基本情况1.1 概述1.2 基本情况3 职责3.1 验证委员会3.2 工程处3.3 QC4 验证内容4.1 安装确认4.1.1 安装确认所需文件资料4.1.2 关键性仪表及消耗性备品4.1.3 评价仪器的安装是否符合GMp及供应商提议的要求4.1.4 起草标准操作规程4.2 校正4.2.1 紫外检测器4.2.1.1 固定波长紫外检测器波长示值误差的校正4.2.1.2 可调波长紫外—可见光检测器波长示值误差和重复性误差的检定4.2.2 高压泵4.3 运行确认4.3.1 紫外检测器4.3.2 高压泵4.4 性能确认4.4.1 最小检测浓度4.4.2 定性、定量测量的重复性4.5 拟订再验证项目及周期4.6 验证结果评定与结论1.设备基本情况1.1 概述本高效液相色谱仪主要由一个二元泵、一个柱温箱、一个可变紫外检测器、一个带有20μL定量环的进样器和一台工作站组成，各部分由工作站软件控制。本仪器主要用于分析原料和成品的有关物质和含量。1.2 基本情况设备编号：设备名称：高效液相色谱仪型 号：生产厂家： 供货厂家： 安装日期： 使用部门： 工 作 间： 保 管 员：2．验证目的 为确认高效液相色谱仪测试数据准确可靠，性能稳定，特制订本验证方案，对高效液相色谱仪进行验证。验证过程应严格按照本方案规定的内容进行，若因特殊原因确需变更时，应填写验证方案变更申请及批准书，报验证委员会批准。3 职责3.1 验证委员会1.负责验证方案的审批。2.负责验证的协调工作，以保证本验证方案规定项目的顺利实施。3.负责验证数据及结果的审核。4.负责验证报告的审批。5.负责再验证周期的确定。3.2 工程处1.负责设备的安装、调试，并做好相应的记录。2.负责建立设备档案。3.负责数字显示器、记录仪的校正。3.3质量部1.负责验证用对照品、样品及其它消耗性备品的准备2.负责备品、备件的保存。3.负责设备仪器的操作。4.负责记录各种测试结果。5.负责拟订再验证项目及周期。6.负责收集各项验证、试验记录，起草验证报告，报验证委员会。7.负责起草仪器使用、维护保养的标准操作规程。4 验证内容4.1 安装确认4.1.1 安装确认所需文件资料 工程处在设备开箱验收后建立设备档案，整理使用手册等技术资料，归档保存。4.1.2 关键性仪表及消耗性备品 列出关键性仪表及消耗性备品的目录，汇总统计，作为仪器的关键资料，用来与仪器以后的变动做比较。4.1.3 评价仪器的安装是否符合GMp及供应商提议的要求 查阅设备采购定单、操作手册等，列出设备安装、使用所需条件，包括温度、湿度、通风条件、电路等。检查仪器安装与使用所处的环境条件，是否符合上述要求。4.1.4 起草标准操作规程--高效液相色谱仪标准操作规程--高效液相色谱仪维护保养规程--高效液相色谱仪校正规程4.2 校正4.2.1 紫外检测器4.2.1.1 固定波长紫外检测器波长示值误差的校正通常用一块滤光片获得指定波长的光者，可小心将滤光片取出，用高精度的分光光度计检定。4.2.1.2 可调波长紫外—可见光检测器波长示值误差和重复性误差的检定取120℃干燥至恒重的基准重铬酸钾约60mg，精密称定，用0.005mol/l硫酸溶液溶解并稀释至1000ml，摇匀，即得重铬酸钾的硫酸溶液将检测器与记录仪联好，接通电源预热稳定后，用注射器注入重铬酸钾的硫酸溶液将吸收池充满，在235nm、257nm、313nm、350nm波长处检定仪器的波长示值误差。将记录纸速调到4mm/min，将检测器波长调到较规定波长低5nm处（例如检定257nm时，检测器波长先调到252nm，调记录笔到中间位置，然后每15秒改变1nm，直至规定的波长高5nm处，记录各点的吸收度，分别找出最小与最大点的波长与标准波长之差即为波长示值误差。每点重复测3次，最小与最大值之差即为波长重复性误差。标 准：固定波长紫外检测器波长示值误差应<±2nm可调波长紫外-可见检测器波长示值误差应<±2nm，重复性误差<±1nm。基线漂移≤5×10-3（AU/h）；基线噪声≤5×10-4（AU）最小检测浓度（静态）_ch 4×10-8g/ml（奈的甲醇溶液）。4.2.2 高压泵校正泵流量设定值：将仪器的输液系统、进样器、色谱柱和检测器连接好，以甲醇为流动相，按表1设定流量，待流速稳定后，在流动相排出口用事先清洗称重过的容量瓶收集流动相，同时用秒表计时，准确收集至规定的时间，称重，按下式计算SS。表1 SS的检定
流量设定值（ml/min）0.51.02.0测量次数333收集流动相时间（min）864允许误差3%2%2%计算公式：Fm=(W2-W1)/ρ·t Ss =(Fm-Fs)/Fs ×100%其中：Fm为流量实测值(ml/min)，Fs为流量设定值(ml/min)，W2为容量瓶加流动相的重量(g)，W1为容量瓶的重量(g)，ρ为实验温度下流动相的密度(g/cm3)，t为收集流动相的时间(min)4.3 运行确认进行运行确认的目的是在不使用任何试样的条件下，确认该仪器能够达到设计要求。4.3.1 紫外检测器基线漂移和基线噪声的测定。将仪器的各部分连接好，紫外检测器波长调到254nm，流动相为100%甲醇，流速为1.0ml/min，纸速为5mm/min，吸收度范围选择最灵敏档，开机，待基线稳定后，记录基线30~40分钟，计算基线漂移和噪声。基线漂移应≤5×10-3(AU/h),基线噪声应≤5×10-4(AU)。4.3.2 高压泵流量稳定性误差SR的检定。将仪器的输液系统、进样器、色谱柱和检测器连接好，以甲醇为流动相，按表2 设定流量，待流速稳定后，在流动相排出口用事先清洗称重过的容量瓶收集流动相，同时用秒表计时，准确收集至规定的时间，称重，按下式计算SR。表2 SR 的检定流量设定值（ml/min）0.51.02.0测量次数333收集流动相时间（min）864允许误差3%2%2%计算公式：SR =(Fmax-Fmin)/F×100% 其中：Fmax为同一组测量中流量最大值（ml/min），Fmin为同一组测量中流量最小值（ml/min），F 为同一组测量中算术平均值（ml/min）。4.4性能确认4.4.1 最小检测浓度在静态条件下，用注射器注入4×10-8g/ml萘的甲醇溶液，样品峰高应大于或等于两倍基线燥声峰高，按下式计算最小检测浓度。Ct=2·HN.C/H式中：Ct:最小检测浓度（g/ml）HN:噪声峰高（记录仪格数或实测高度cm）C:样品浓度（g/ml）H:样品峰高（记录仪格数或实测高度cm）4.4.2 定性、定量测量的重复性将1×10—4g/ml 萘的甲醇溶液，注入高效液相色谱仪中，检测波长254nm，流动相为甲醇，流速1.0ml/min。重复进样8次，计算相对标准偏差（RSD），应小于等于1.5%。4.5拟订再验证项目及周期 质量处负责根据设备仪器情况，确定再验证周期项目及周期，报验证委员会审核。4.6 验证结果评定与结论QC负责收集各项验证、试验结果记录，起草验证报告，报验证委员会。验证委员会负责对验证结果进行综合评审，做出验证结论。附件1关键性仪表及消耗性备品情况
仪器名称仪器编号型 号关键性仪表仪表名称生产厂家型号校正证书编号保存处校正周期消耗性备品品名生产厂家型号数量单位保存处 确认使用部门 年 月 日工程部 年 月 日验证委员会 年 月 日附件2 仪器安装条件检查记录
设备名称设备编号型 号安装条件要求实际安装条件温度10～30℃湿度小于65%通风水电气汽其它条件
工作台不受阳光直射。室内应无腐蚀性气体或其它影响测定的气体干扰。周围应无影响测定的强电场、磁场和强烈震动。确认使用部门 年 月 日工程部 年 月 日验证委员会 年 月 日
随着科学技术的进步,液相色谱用户对液相色谱技术的要求也不断提高,他们需要“更快地得到更好的结果”。因此,超高效液相色谱(Ultra Performance LC)概念的提出也就十分自然;简单的说:UPLC(超高效液相色谱)是用HPLC(高效液相色谱)的极限作为自己的起点,把分离科学推向一个新领域。
超高效液相色谱应用范围广泛,主要应用类型为高沸点中分子,高分子有机化合物,离子性无机化合物,热不稳定具有生物活性的生物分子。
三聚氰胺(分子式C3N6H6)是一种重要的氮杂环有机化工原料,具有肾毒性。三聚氰胺分子中含有大量氮元素,而普通的凯氏定氮法测定乳粉及食品中的蛋白质含量时无法区分氮元素来源于蛋白分子还是三聚氰胺的氮杂环,因而一些厂商为了降低成本而添加这种化工原料,以提高产品中蛋白质含量检测值。因此,才衍生了乳制品中三聚氰胺的检测方法。三聚氰胺是一种有机化合物,因此采用超高效液相色谱法检测。
检验依据
参照GB/T 22388-2008《原料乳与乳制品中三聚氰胺检测方法》第一法
检验原理
样品用三氯乙酸溶液和乙腈提取,经阳离子交换固相萃取柱净化后,用超高效液相色谱仪测定,外标法定量。
相关仪器及试剂
1. 仪器和设备
超高效液相色谱仪:美国沃特世Waters Acquity UPLC
检测器:光电二极管阵列(PDA),此检测器属于固定波长紫外检测器
色谱条件:色谱柱Acquity UPLC BEH HILIC 1.7μm柱温35℃
流动相:乙腈-乙酸铵溶液(0.02 mol/L),体积比为97:3
流速:0.5 m L/min
进样量:2μL
进样器为自动进样器,波长:210 nm。
电子天平:精确度为0.0 001 g,上海精密仪器仪表有限公司
离心机:高速冷冻离心机,最高转速16 000 r/min
真空过滤装置:300 m L
具塞塑料离心管:50 m L
超声波清洗器:KQ3200DE型,昆山市超声波仪器有限公司
固相萃取装置:天津奥特赛恩斯仪器有限公司
氮气吹干仪:天津奥特赛恩斯仪器有限公司
真空泵:天津奥特赛恩斯仪器有限公司
漩涡混合器:江苏省金坛市荣华仪器制造有限公司
超纯水机:重庆摩尔水处理设备有限公司
2.试剂与材料
甲醇:色谱纯
乙腈:色谱纯
乙酸铵:分析纯
氨水:含量为25%~28%
三氯乙酸:分析纯
三聚氰胺标准品:CAS108-78-01,纯度大于99.0%,来源于中国计量科学研究院
阳离子交换固相萃取柱:混合型阳离子交换固相萃取柱,基质为苯磺酸化的聚苯乙烯-二乙烯基苯高聚物,60 mg,3 m L
氮气:纯度≥99.999%
微孔滤膜:0.2μm,有机相、无机相。定性滤纸。
实验用水为超纯水,阻值在18 MΩ以上。
3.试剂的配制
(1)标准溶液的配制(表1)
三聚氰胺标准储备溶液(浓度为1 mg/m L):准确称取100 mg(精确至0.1 mg)三聚氰胺标准品于100 m L容量瓶中,用甲醇水溶液溶解并定容至刻度,混匀,即配制成浓度为1 mg/m L的三聚氰胺标准储备溶液,于4℃避光保存。
三聚氰胺标准工作液:分别吸取三聚氰胺标准储备溶液(1 mg/m L)0 m L、1.0 m L、2.0 m L、3.0 m L、4.0 m L、5.0 m L,放入50 m L容量瓶中,用流动相定容至刻度,相当于浓度为0μg/m L、20μg/m L、40μg/m L、60μg/m L、80μg/m L、100μg/m L的三聚氰胺标准工作液,标准工作液经0.2μm有机相滤膜过滤。
(2)流动相的配制
乙腈:色谱纯。
乙酸铵溶液(0.02 mol/L):称取1.54 g乙酸铵,加水定容至1 000 m L,溶解,经0.2μm水系滤膜过滤(现用现配)。
(3)其它试剂的配制
氨化甲醇溶液(5%):准确量取5 m L氨水和95 m L甲醇,混匀后备用。
三氯乙酸溶液(1%):准确称取10 g三氯乙酸于1 L容量瓶中,用水溶解并定容至刻度,混匀后备用。
甲醇水溶液:准确量取50 m L甲醇和50 m L水,混匀后备用。
阳离子交换固相萃取柱:使用前依次用3 m L甲醇、5 m L水活化。
样品的处理
称取样品2 g(精确至0.01 g)于50 m L具塞塑料离心管中,加入15 m L三氯乙酸溶液和5 m L乙腈,用超声波提取10 min,再振荡提取10 min后,以10 000 r/min转速、温度5℃、离心10 min,离心沉淀后,取上清液经三氯乙酸溶液湿润的滤纸过滤后,用三氯乙酸溶液定容至25 m L,移取5 m L滤液,加入5 m L超纯水混匀后,转移至固相萃取柱中,依次用3 m L超纯水和3 m L甲醇洗涤,抽至近干后,用6 m L氨化甲醇溶液洗脱。整个固相萃取过程流速不超过1 m L/min。洗脱液于50℃下用氮气吹干,残留物用1 m L流动相定容,漩涡混合1 min,经0.2μm有机相滤膜过滤,供UPLC测定。
空白实验
除了不称取样品外,均按照样品的处理方式进行前处理。
仪器测定
1.标准曲线的绘制
将浓度为0μg/m L、20μg/m L、40μg/m L、60μg/m L、80μg/m L、100μg/m L的三聚氰胺标准工作液在选定的色谱条件下浓度由低到高进行检测分析,以峰面积A对浓度C绘制标准工作曲线。峰面积与浓度呈良好的线性关系,线性相关系数r=0.999 743,具体数值见表2。
2. 样品检测
依次将处理好的空白、样品在与三聚氰胺标准工作液同样的色谱条件下进行检测分析,即可得出空白、样品的浓度值,然后进行结果计算。
3. 结果计算
计算公式:
X——样品中三聚氰胺的含量,单位是毫克每千克(mg/kg)
C——进样中的三聚氰胺的浓度,单位是微克每毫升(μg/m L)
C0——空白实验三聚氰胺的浓度,单位是微克每毫升(μg/m L)
m——样品的质量,单位是克(g)
V1——样品的定容体积,单位是毫升(m L)
V2——取样体积,单位是毫升(m L)
V3——稀释定容体积,单位是毫升(m L)
检测结果与结论
经计算,检测结果为54.91 mg/kg,在全省实验室能力验证的允差范围内。结论是阳泉市质量技术监督检验测试所已具备乳制品中三聚氰胺的检测能力。
注意事项
1.流动相使用前要经过脱气和过滤处理。
2.使用前后都要清洗柱子,以防柱压升高。
3. 三聚氰胺标准工作液配制的准确度直接影响标准工作曲线的线性关系,从而影响样品的检测结果。
4. 实验用水为超纯水,阻值在18 MΩ以上。
5. 三聚氰胺标准储备溶液要求4℃避光保存,以保证标液的稳定性。
6. 所有三聚氰胺标准工作液和样品进仪器前都要经过0.2μm有机相微孔滤膜过滤。
7. 色谱柱Acquity UPLC BEH HILIC 1.7μm在不工作时,要用100%甲醇注满。
8. 整个固相萃取过程流速不超过1 m L/min。
9. 三聚氰胺标准工作液要用流动相定容,并用0.2μm有机相微孔滤膜过滤。
10. 乙酸铵溶液要现用现配。
摘要：超高效液相色谱仪分析是20世纪60年代中期提出并发展起来的新型光谱分析技术,它具有超强分离能力、超高分离速度、超高灵敏度、选择性高、简单方便的方法转换等优点。
（1）请你设计一个验证性小实验，证明“在气体中，流速越大的位置压强越小”。
用手握着两张纸，让纸自由下垂，在两张纸的中间向下吹气，发现两张纸向中间靠拢，这说明在气体中，流速越大的位置压强越小。
2.请你设计实验验证：使用滑轮组可以省力。
用弹簧测力计测出一个钩码的重力，然后将钩码挂在滑轮组下，用弹簧测力计拉动滑轮组绳子的自由端做匀速直线运动，发现测力计的示数比钩码的重力小，这就说明使用滑轮组可以省力。
3.请你利用弹簧、木块设计实验验证：物体的弹性形变越大，弹性势能越大。
将弹簧放在水平桌面上，一段固定，另一端分别用不同的力推动木块压缩弹簧后迅速松手，发现弹簧被压缩的越短，木块被推出的越远，这就说明物体的弹性形变越大，弹性势能越大。
4.请你设计实验验证：动能和势能可以相互转化。
将滚摆旋至顶端后松手，发现滚摆上下反复运动，且向下运动时速度加快、向上运动时速度减慢，这说明动能和势能可以相互转化。
1.请你完成“探究摩擦力与绳子缠绕圈数的关系”的实验设计方案：
步骤：①将线绳在横杆上缠绕1圈，线绳一端悬挂重物，用弹簧测力计向上拉着线绳的另一端，做匀速直线运动，读出弹簧测力计的示数；②将线绳在横杆上分别缠绕2圈、3圈，重复上述实验。将数据记录在表格中，分析数据得出结论。表格：
2.请完成下列探究实验的设计方案：
表格
3.4.问题解决：
1、器材：薄壁平底试管、刻度尺、小木块、水、细铁丝、设计实验测出木块密度，推导出木块密度表达式。（配图说明）
2、器材：弹簧、刻度尺、细线、不规则小石块、水
卤化丁基橡胶塞二次灭菌后性能验证
一、目的：
1、考察卤化丁基胶塞两次灭菌后的性能变化；
2、通过实验数据对比，为胶塞二次灭菌的可行性提供依据。
二、试验依据：
1、YBB00042005注射液用卤化丁基橡胶塞
2、YBB00052005注射用无菌粉末用卤化丁基橡胶塞
3、Q/320281YDZ 1-2011注射用冷冻干燥无菌粉末用卤化丁基橡胶塞
三、试验方案：
1、取清洗干净的卤化丁基胶塞1000只，在高压灭菌器中121℃×30min灭菌；
2、将灭菌后的胶塞在90℃×2h条件下干燥，待用；
3、按照YBB00052005标准或Q/320281YDZ 1-2011标准用上述胶塞做全项检验（说明：溶血、全身急性毒性试验未作，热原试验用细菌内毒素试验替代）；
4、将上述实验剩余胶塞（即第一次灭菌胶塞）按照步骤1、2进行第二次灭菌处理，再按照步骤3进行全项检验；
5、将第二次灭菌后试验剩余胶塞再按照步骤4进行第三次灭菌及全项检验；
6、分别按照上述实验步骤，注射用无菌粉末用卤化丁基橡胶塞和注射用冷冻干燥无菌粉末用卤化丁基橡胶塞各做10组试验；
7、由于注射液用卤化丁基橡胶塞是终端灭菌，本方案没有进行验证。
四、结论：
1、对上述每类胶塞的10组试验数据进行整理并进行对比分析，找出卤化丁基橡胶塞经过第一、二、三次灭菌后的性能变化趋势。
2、通过数据分析，得出结论。
编制：审核：批准：
