随着对与肿瘤发生的相关基因研究发现, 磷脂酰肌醇3-激酶 (Phosphatidylinosito1 3-kinase, PI3K) 和AKT通路等与肿瘤密切相关信号通路, 逐渐引起重视[1]。PI3K信号参与细胞的增殖、分化、凋亡和葡萄糖转运等多种细胞过程, 而研究发现, PI3K/Akt信号通路在大肠癌中处于激活状态[2]。该组研究拟检测正常大肠粘膜、大肠腺瘤、大肠癌组织中PI3K p85α表达的变化趋势, 然后设计针对PI3K p85α的RNA干扰片段, 转染大肠癌细胞后, 测定PI3K p85α的mRNA、蛋白表达量, 分析干扰效果。报道如下。
自GenBank中选择人类PI3K p85α亚单位编码基因PIK3R1mRNA序列 (NM_181504) , 按shRNA设计一般原则, 设计4条shRNA, 依次命名为:shRNA/89, shRNA/324, shRNA/1 073, shR-NA/1 123。阴性对照靶序列为:GTT CTC CGA ACG TGT CAC GT, 命名为:shRNA/N。shRNA的发卡袢状结构TTC AG AGA, 转录终止子为TTTTT。
美国ATCC人结肠腺癌细胞株LoVo, 使用含10%的胎牛血清 (海诚远宏科技有限公司) 的RPMI 1 640 (Gibco公司) 常规培养传代。细胞融合度高于90%时即开始转染, 以Opti-MEM培养液将脂质体及质粒载体进行稀释。转染后24 h内, 将1 000μg/mLG418加入培养液中筛选。使用尖吸管吸取形成后的单细胞阳性克隆群落, 培养30 d后, 用浓度为600μg/mL的G418的培养液进行培养。细胞分成5个对照组: (1) 转染shRNA/N阴性对照组; (2) 转染shRNA/89的LoVo细胞组; (3) 转染shRNA/1 073的LoVo组; (4) 转染shRNA/324的LoVo组; (5) 转染shRNA/1 123的LoVo组。
采用RIPA裂解液提取细胞总蛋白 (北京普利莱基因技术有限公司) , 采用蛋白质印迹法检测PI3K p85α蛋白的表达。
所有统计均在WindowsSPSS 17.0统计学软件中完成, 计量资料采用均数±标准差 (x±s) 的方式记录, 均数均以组间t检验进行比较, 计数资料采用组间χ2检验。检验水平α=0.05。
待稳定的转染克隆细胞形成后, 采用Western blotting测定RNA干扰。研究结果发现, 与阴性转染LoVo对照组对比, 转染干扰载体LoVo细胞PI3K p85α蛋白相对表达量分别降低35% (shRNA/89) 、76% (shRNA/324) 、23% (shRNA/1 073) 、18% (shRNA/1123) , shRNA/324转染组比较, shRNA/324转染组shRNA/87转染组均显著降低 (P<0.05) 。其中, 以shRNA/324转染组PI3K p85a表达量减小幅度最高, 因此, 采用shRNA/324转染组为后续实验感染组。
24 h体外划痕研究发现, 与阴性对照组比较, 转染shRNA324载体的干扰组LoVo细胞从12 h开始迁移能力明显减弱 (P<0.05) 。
大肠癌是常见的恶性肿瘤之一, 大肠癌的治疗主要以手术切除为主, 化放疗为辅, 虽然短期效果明显, 但毒副反应巨大, 患者需承受巨大痛苦, 且复发率高, 尤其对于已转移患者, 远期疗效差。因新的治疗机制及手段亟待发现[3]。
PI3K/Akt信号通路与肿瘤发生发展密切相关, 在许多肿瘤中IA型PI3K的催化产物PI (3, 4, 5) P3可激活信号传递的下游效应分子, 引起肿瘤细胞增殖, 抑制肿瘤细胞凋亡。IA型PI3K是由p85α/β、p55γ通过选择剪切产生的7种异构体 (调节亚基和p110α/β/δ/γ (催化亚基) 构成的异二聚体, p85调节亚基能够有效稳定p11 0催化亚基, 且对IA型PI3K的激活也是必要的[4]。p85α是PI3K中表达量最高的一种调节亚基, 自从有研究表明p85α突变可激活PI3K/Akt通路, 从而进一步证实PI3K p85aα为癌基因以来, 就陆续发现在许多癌组织中存在p85α基因的突变。但是将PI3K p85aα基因干扰掉, 同时检测其是否通过激活下游FOXO转录因子家族来调控大肠癌细胞的生存及凋亡, 国内外均未见报道。该实验首次利用RNA沉默PI3K p85α用于对大肠癌治疗意义的研究, 在体外检测转染后细胞增殖和细胞凋亡的变化, 探讨干扰PI3K p85α后是否通过激活下游的F0X0转录因子来实现对上述变化的调控, 并且在体内检测转染后细胞成瘤能力的大小, 在组织水平检测PI3K p85α在正常大肠上皮组织、大肠腺瘤、大肠癌中的变化趋势, 以此为发现大肠癌基因治疗新的靶点提供理论依据。
该组中, 体外划痕研究发现, 与阴性对照组比较, 转染shRNA/324载体的干扰组LoVo细胞从12 h开始迁移能力明显减弱 (P<0.05) 。进一步证实, 因PI3K p85α异常引起的肿瘤细胞运动力增强是导致大肠癌转移的重要机理。总之, 本组研究表明, RNA干扰靶向可有效抑制PI3K p85α蛋白表达, 降低肿瘤细胞的运动转移能力, 这对加深科研人员及临床医生对PI3K p85α的认识, 为更加准确预测转移复发及开发新的基因治疗方法具有重要意义。
摘要：目的 分析RNA干扰靶向抑制PI3K p85α表达对大鼠大肠癌细胞的侵袭及转移的影响。方法 设计1条阴性载体及4条shRNA干扰载体转染大肠癌细胞, 检测shRNA干扰载体对减少PI3K p85α蛋白表达的作用。结果 shRNA/324转染组PI3K p85α蛋白表达量降低幅度最大;转染shRNA/324载体的干扰组LoVo细胞迁移能力显著减弱 (P<0.05) 。结论 RNA干扰靶向可有效抑制PI3K p85α表达并降低肿瘤细胞运动迁移能力。
关键词：RNA干扰,PI3K p85α蛋白,大肠癌
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